宰后肉品嫩化技术及其作用机理研究进展

　　摘要：嫩度是表征肉品食用品质的重要指标，消费者对肉品嫩度期望感利于重复购买。由肌肉转变为可食用肉，涉及复杂的生理生化过程，宰后肉类成熟与嫩化处理可有效改善肉品品质。本文就当前宰后肉品成熟机制、嫩化技术（生物、化学、物理）及相关机理进行综述，并辅以图解与展望，从而为宰后肉品半加工或全加工提供理论参考。

　　关键词：肉品；成熟；嫩化技术；嫩化机理；图解

　　肉品嫩度是消费者购买肉与肉制品的首要衡量标准，作为一种复杂的品质特性，嫩度受宰前与宰后多种因素的影响。调控宰前嫩度主要通过饲料种类及管理技术，该过程具有系统性与长期性。而宰后嫩化方法较多，短时高效，更易获得品质优良的商业化产品。肉品嫩度受内外因素影响，内部因素包括：结缔组织数量和胶原蛋白溶解度、僵直过程中的肌节短缩以及可影响宰后肌原纤维及肌原纤维相关蛋白水解的钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白等。而外部因素如肌纤维变性、收缩及相关水分损失的平衡、热处理引起的增韧、蛋白溶解/凝胶化等均会影响嫩度。肉品嫩度作为肉品品质与质地的表征特性之一，决定肉品烹调与加工后的感官体验。关于宰后肉品嫩化方法的报道屡见不鲜，部分技术作用机理存在争议与不足，本文将从肉品成熟嫩化理论、宰后嫩化方法及相关机理解释(主要针对新兴嫩化技术)等方面进行综述。

　　1  肉品嫩化理论及成熟机制

　　宰后畜禽肉伴随着僵直、解僵、成熟和腐败等一系列生理生化变化过程，可引起胶原蛋白含量/溶解度、肌肉短缩程度及成熟过程中结构蛋白的变化，肉品保水性、色泽、嫩度等受到影响。肉品成熟机制的研究由来已久，包括钙蛋白酶学说、钙张力学说、钙离子学说、组织蛋白酶学说，该节仅对主流钙蛋白酶嫩化肉品机理及当前普遍接受的成熟机制进行综述。

　　1.1.1  钙蛋白酶体系

　　当前研究表明，参与宰后肌肉蛋白质降解的蛋白酶中以钙蛋白酶(calpain)起主要作用。calpain的蛋白水解活性受肌浆Ca2+浓度、钙蛋白酶抑制蛋白/钙蛋白酶比例、pH值、温度和氧化等内外环境因素的影响，钙蛋白酶体系包括钙依赖性半胱氨酸蛋白酶的calpain及其抑制蛋白(均需Ca2+激活)。钙蛋白酶亚型众多，以μ-钙蛋白酶(μ-calpain，结合肌原纤维为主)和m-钙蛋白酶(m-calpain，位于细胞溶质)研究最为深入。μ-calpain与m-calpain 均可水解肌原纤维，但后者激活所需Ca2+浓度远高于前者，宰后成熟过程中活性几乎不变，且两者宰后作用时间不同。μ-calpain宰后前3天即被激活并伴随自溶，发挥其水解蛋白活性，降解肌肉中主要的肌原纤维蛋白，而m-calpain宰后成熟前期并未被激活，可能在嫩化末期发挥作用，故普遍认为是μ-calpain而非m-calpain参与肉品嫩。

　　钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)可抑制蛋白酶水解活化、膜结合和催化活性的表达。畜禽宰后，肌肉中calpastatin含量逐渐减少，其降解/失活的速度与肌肉中蛋白质的水解有关，通过与μ-calpain和m-calpain之间的相互作用共同参与调控宰后嫩度。

　　其次，宰后肌肉中存在大量可磷酸化钙蛋白酶系统的蛋白激酶，因此具备发生磷酸化的条件。具备肌肉收缩功能的蛋白质如肌钙蛋白磷酸化后会降低钙蛋白酶对其降解的能力，宰后糖酵解酶磷酸化后酶活性改变，进而影响糖酵解进程、肌肉僵直过程及最终的肉品品质。宰后肌肉中，μ-/m-calpain与calpastatin磷酸化是否会影响其自身活性，进而影响嫩化进程，磷酸化calpastatin如何影响对calpain的抑制能力等，这些问题仍需进一步研究验证，以便明确钙蛋白酶系统在动物宰后肌肉中的活性调控机制，丰富和发展钙蛋白酶嫩化理论，为改善肉品质提供新的思路。

　　1.1.2  钙蛋白酶嫩化机理

　　钙蛋白酶可降解肌原纤维中的关键蛋白质，包括伴肌动蛋白、肌联蛋白、肌钙蛋白-T和肌间线蛋白等；亦可破坏肌肉超微结构、Z线弱化并消失，促进肌原纤维小片化，改善肌肉嫩度。钙蛋白酶嫩化作用表现为图1(略)：(1)钙蛋白酶降解伴肌球蛋白与伴肌动蛋白、弱化细线与Z线的相互作用，引起肌原纤维I带和Z线结合变弱或断裂；(2)钙蛋白酶降解肋节、肌间线蛋白和丝蛋白后，肌纤维有序结构被破坏、破坏肌纤维与外周或肌纤维之间的完整性；(3)钙蛋白酶降解类原肌球蛋白，弱化粗细丝之间的键合，刺激解僵；(4)促进肌钙蛋白中原肌球蛋白结合亚基肌钙蛋白-T(Troponin-T，Tn-T)的降解，弱化细丝结构，提高嫩度。

　　1.2  肉品成熟机制

　　目前广泛提出的一种多机制共同成熟作用如图2所示。即(1)钙蛋白酶在肌肉成熟嫩化过程中起主导作用，钙离子通过激活该酶而发挥间接作用；(2)细胞凋亡酶参与了早期阶段的肌肉成熟，对肌联蛋白和伴肌动蛋白有降解作用，调控钙激活酶系统；(3)钙蛋白酶作为一种半胱氨酸蛋白酶，蛋白质巯基亚硝基化通过修饰钙蛋白酶活性位点的半胱氨酸残基，影响其自溶性与蛋白水解活性；capase-3(一种细胞凋亡酶)去硝基化可被激活，进而诱导细胞凋亡；蛋白亚硝基化还可修饰钙离子释放通道，影响其释放速度，引起肌肉不同程度的收缩及细胞内不同水分的分布；并且，参与宰后糖酵解的酶(如磷酸果糖激酶)经亚硝基化修饰后，活性受到抑制，影响宰后pH下降速率及终点pH，进而影响肉品成熟品质。(4)蛋白磷酸化修饰对肌肉成熟存在影响；此外，当前亦发现热休克蛋白等也参与了嫩化进程调控，需作进一步的研究。

图2  多机制共同作用肉品成熟

　　由于结缔组织强度增加和内源性蛋白水解酶能力不足，老龄动物特定肌肉仍具有相当大的韧性，因而可通过添加外源酶提高肉品嫩度。常用外源酶及其作用如表1所示。植物蛋白酶中以木瓜蛋白酶(papain)研究最为广泛，其含有的巯基肽内切酶几乎可水解所有的肽键，且在不同pH环境下均可分解蛋白。活性papain不可直接注射活体动物，经H2O2氧化失活后颈静脉注射，因宰后蒸煮缺氧条件而被重新激活，促进酶活性部位半胱氨酸残基减少和肌肉中的结缔组织及肌纤维中结构较复杂的胶原蛋白、弹性蛋白的降解。需要注意的是，不同研究者研究过程中所用酶浓度、纯度各异，因而植物蛋白酶嫩化效果很难取得统一趋势；除此之外，肉品切块方式、存储温度及其余干预措施亦对嫩化效果存在影响。植物蛋白酶失活温度高于微生物蛋白酶，高温煮制可能导致过度嫩化，需将时间、温度、酶-底物比等因素纳入考虑。此外，相对于快速蒸煮肉块，缓慢蒸煮过程中的蛋白酶水解活性表达更高，若需产生同快煮相同的嫩化效果，需降低慢煮过程中所添蛋白酶浓度。

　　传统植物蛋白酶具有广泛的特异性，易导致不良结果(浆糊质地、风味差)，而微生物蛋白酶具有自限活性的特点，且针对底物蛋白特异性强。例如，提取自米曲霉的天冬氨酸蛋白酶只作用于肌原纤维蛋白(MP)而对结缔组织无影响；嗜碱芽孢杆菌的弹性蛋白酶对肌原纤维水解活性低而对弹性蛋白特异性强，进而可避免过度嫩化。外源酶应用于肉品嫩化，需要综合考量其来源及商用制剂纯度、有效使用水平的安全性、消费者可接受性、感官品质影响及成本。

　　2.2  化学法嫩化

　　2.2.1  盐法嫩化

　　盐类主要影响肉品功能特性，与肌肉收缩、蛋白质间相互作用、蛋白溶解度、酶活性及蛋白质晶格膨胀有关。如图3（略）：

　　氯化物结合到纤维上增强纤维间排斥静电力，造成蛋白晶格膨胀，膨胀的一个关键因素可能是在临界盐浓度下，去除肌原纤维中一个或多个横向结构(可能是联桥、M线或Z线)的约束。复合磷酸盐可促进离子效应和pH变化，低浓度复合磷酸盐(碱性)即可改变蛋白质电荷的电势，进而提高离子强度，引起等电点偏离、电荷间相互排斥，蛋白间空间得以增大，促进肉组织包含更多水分；此外，还可提高胶原蛋白溶解度(胶原蛋白含量过多可降低肉品保水性能)、减少结缔组织中胶原蛋白的交联，从而改善肉品嫩度。多聚磷酸盐可影响肌动球蛋白复合物的解离。钙盐最主要的作用是通过外加钙提高肌肉体系中Ca2+浓度，进而激活钙蛋白酶，引起相关组织结构破坏及纤维蛋白降解。亦有研究表明高浓度的Ca2+渗透肌细胞中，钙激活中性蛋白(CANP)与碱性磷酸酶被激活，促进糖酵解，加速溶酶体破裂，组织蛋白渗出，共同促进了嫩度的提高。无磷保水剂不含磷酸盐，同样具有类似磷酸盐的作用，以碳酸氢钠(碳酸盐，常作为无磷保水剂)为例，克服了磷酸盐保水剂的缺陷，不用担心添加量过高而影响产品的口感，但碳酸盐一般呈碱性，对蛋白具有腐蚀作用，破坏蛋白组织结构，需要考虑营养损失情况。

　　由此可见，参与肉品嫩化的盐类主要包括氯化物(钠盐与钙盐)、磷酸盐(复合与多聚)、无磷盐(碳酸盐)等。涉及盐法嫩化机制可简述为：(1)提高肉品保水性；(2)降低胶原蛋白热稳定性；(3)离子强度对蛋白质-蛋白质、蛋白质-水之间相互作用的影响；(4)蛋白水解酶(钙蛋白酶)的激活。

　　2.2.2  有机酸嫩化

　　有机酸(醋酸、柠檬酸和乳酸等)嫩化肉品主要通过改变肌肉内部环境，进而改变钙激活酶活性。以浸渍法和注射法为主，其作用机制可概述为：(1)影响肌原纤维主轴膨胀而使承载物质稀释；(2)肌束膜中结缔组织强度降低；(3)低pH值下的蛋白酶(主要是组织蛋白酶)加速了嫩化作用；(4)酸处理降低了肉的机械抵抗力。由于外源酸渗透缓慢，浸渍处理需要达到充分的浸渍时长，注射则可使酸溶液较快地扩散而加速嫩化。

　　2.3  物理法嫩化

　　2.3.1  传统物理法嫩化

　　电刺激多用于大型动物(牛、羊、鹿等)，可加快ATP降解与糖元分解速度，pH下降，冷加工后可防止肌节缩短(冷收缩)；电刺激引起溶酶体水解酶的释放，可破坏肌肉组织，加快蛋白水解，使肉质变嫩。水分灌注/增强技术(如钙离子溶液注射技术)亦能有效改善肉品嫩度及多汁性。机械嫩化法则是通过对肉进行柔和切割，破坏肌间结缔组织和肌纤维细胞以增强嫩度。尸僵时肉品嫩度与肌肉收缩程度密切相关，嫩度拉伸技术或其余拉伸技术则可通过施加与收缩张力相反的力，提高肌原纤维小片化指数，阻止肌节缩短，但也可能引起肌肉破坏和嫩化；而当前又出现智能拉伸技术，其不局限于完整酮体，且可减少冷冻室空间和能量需求、提高肉块大小与形状的控制，同样具有良好的嫩化效果。但应用研究有限，尤其是针对肉块拉伸和成形过程中分子变化的基础研究不足，不同肌肉智能拉伸后肌节长度、峰值剪切力(PSF)和嫩化程度的差异等还未得到充分的理解；值得注意的是，肌肉收缩的程度随肌肉类型而变化，反映在僵直期内的糖酵解、温度与pH的变化，因此，对肌肉拉伸和成形进行研究相当重要，以确保在商业应用中取得一致的最终结果。传统物理技术均取得一些成功应用，至今这些技术依然广泛存在，但其具有在线应用差、当代消费者对技术的不可接受性等不可避免的缺陷，促使广大研究者对新型物理嫩化的研究。

　　2.3.2  新兴物理法嫩化

　　2.3.2.1  高压加工技术

　　高压加工技术(HPP)是一种通过液体介质对产品施加静电压力的技术，高压应用时，会发生绝缘增热现象(大气受到压缩而升温，且无热量损失)，HPP嫩化效果与宰后肉所处状态密切相关。

　　僵直前肌肉中，HPP有效嫩化应用条件一般为气压100-235MPa、温度10-35℃，该阶段应用引起的嫩化是加速/阻止糖酵解的结果。僵直前肌肉因宰后缺氧，需进行糖酵解以维持ATP生成，同时乳酸积累，肌肉pH下降，压力施加将导致肌原纤维结构大量破坏、Ca2+释放加速糖酵解进程，促进僵直及后期成熟的发展。此外，亦有可能在压力作用下，糖酵解酶发生变性，糖酵解停止，肌肉最终pH(pHu)得以上升，而pHu与嫩度存在二次型关系，pHu6.1时，韧性最高，高于6.1，则表现为嫩度提高/改善，因而当HPP应用于僵直前肌肉时，很难做到肌肉的可靠嫩化。僵直后肌肉中，常温或低温下施加高压一般不引起嫩度变化，甚至有提高韧性的可能(只有少部分在常低温下起到了嫩化效果)；而高温下施加高压通常会改善嫩度，当压力处于150-400MPa、温度高于50-60℃时，大部分实验研究均表现出明显的嫩化效果。

　　总的来说，常/低温下HPP的应用，处理肉需处于僵直前状态，且嫩化结果不稳定；而僵直后肌肉于高温下进行 HPP的应用，可作为潜在的商业加工方法，HPP技术虽不再只视为传统杀菌技术的替代工艺，但其存在市场局限性(色泽不稳定，且压力应用越高，肉品视觉外观变化越大，甚至有“熟”感)，HPP技术不太可能取代传统肉类加工方法，可作为结合方法或现有方法的补充。

　　2.3.2.2  冲击波加工技术

　　冲击波(SW)，又称流体动力学压力，可于毫秒级内瞬间产生高达1GPa的压力波，通常以水为液体介质对肉品进行施压。SW有水下引爆炸药(爆炸冲击波)和水下放电(电生冲击波)两种产生方式，其应用于食品加工已不局限于早期的杀菌作用，在肉类促嫩方面已有大量研究开展。

　　图4（略）为两种冲击波产生方式对肉品嫩化作用示意图。肌肉由75%水分构成，冲击波可在流体(水)或任何与水声学匹配的物体中传播，同时产生与水相匹配的机械阻抗，以产生“破裂效应”。肉品嫩化机制主要有两种：(1)肌肉超微结构的破坏；(2)增强蛋白水解能力或加速成熟。Zuckerman等通过扫描电镜观察发现经SW处理过的肌内膜蜂窝结构变形为松散的网眼状。早期研究发现，爆炸冲击波引起牛背最长肌肌节I带碎裂，Z线周围出现锯齿状边缘，表明肌原纤维遭受物理性破坏，纤维间距扩宽。此外，Bowker等经Western Blotting技术发现，SW将肌钙蛋白-T降解为可表征肉品嫩化性能的小分子量蛋白片段(30KDa)。爆炸冲击波因单位负载产生的能量较电生冲击波脉冲能量大，其嫩化效果更明显，但对处于很嫩状态的肌肉(蛋白酶活性低、结缔组织多、肌节长度相对较短)嫩化困难。此外，对处理肉包装材料要求高，工业推广受限，这归因于爆炸型依赖技术存在潜在安全问题和技术挑战，产品接受度低，基建造价高、器械耐久性差等。而后者可通过重复脉冲、优化脉冲频率、能量设置等调节手段弥补差异。

　　鉴于两种方式优缺点，今后研究可重点围绕新型抗冲击波包装材料的开发、性能更好的冲击波设备研制以及结合其余新型技术对处于不同状态的肉品进行分段/联合作用。

　　2.3.2.3  超声波嫩化

　　如图5所示，超声是一种基于声能的非热技术，声波在高低压之间传播引起微小气泡震荡并逐渐增大，直至气泡破裂形成空化现象，气泡内爆引起的微射流引起物体表面物理性破坏，破坏肌纤维，影响肉品嫩度。此外，空化作用亦会引起分子破裂，诱导自由基形成并加速化学反应，促进蛋白氧化，引起二硫键交联和蛋白聚集物的形成，影响蛋白溶解度，宏观上表现为肉质变硬，需合理控制超声应用时间及强度。一般认为低强度超声（＜10Wcm-2）对肉品嫩化效果不明显，尤其以超声浴池应用体现更明显。肉品宰后时间影响超声作用效应，宰后时间过长的肉品，肉品嫩度因内源蛋白酶水解相关蛋白而降低，超声应用效果模糊；而僵直前肌肉应用主要评估超声对僵直开始及成熟期相关蛋白酶的作用，虽观察到肌节拉伸、Z线破坏，但似乎最终肉品嫩度并未改善，研究者们认为超声应用于肉品应在宰后24h，肉品达到pHu以减少超声嫩化可变性。超声可改善肉中相关蛋白结构特性，激活ATP酶活性，增加巯基含量，多呈现较少的α-螺旋与较多的β-折叠，降低聚集体的形成，改善凝胶三维网状结构，提高肉品持水性能。虽然当前超声提高肉品保水性存在争议，但多数学者认为合适的超声强度能够促进盐或保水剂的渗透，联合效应可进一步增强肉品保水性能。

　　引起肉品嫩化效应的可能机制总结如图6（略)：(1)肌原纤维/组织结构的物理破坏；(2)蛋白水解能力提高，促进成熟过程中肉品的嫩化(如增加组织蛋白酶的释放)；(3)胶原蛋白破裂；(4)细胞膜损伤；(5)空化效应及自由基的形成对蛋白质的理化破坏。

　　超声嫩化技术应当着重基础研究，需集中于评估超声对肉微观结构、酶活性及最终嫩度的影响，并优化工艺参数(频率、强度和处理时间)。由于超声波与肉品科学均复杂，因此超声研究中必须提及所用装置及实验设定参数的具体细节，降低可重复性的难度(当前超声嫩化肉品研究结果存在很大的可变性)，从而推进超声嫩化的进一步发展。

　　2.3.2.4  脉冲电场嫩化

　　脉冲电场(PEF)作为改善食品结构及生物活性的绿色新型非热技术，通过在两个电极之间以直流电压脉冲形成电场，亦可用于肉类嫩化。肉品组织由于细胞尺寸大，一般不需要高强度电场，形成孔径的电场强度约在1-10KV/cm范围内。肉品成熟前对肌肉进行PEF处理，可通过提高细胞膜通透性致使细胞器释放钙离子、钙激活蛋白酶，从而促进肉的嫩化；宰后成熟的嫩化也得益于PEF对蛋白的水解，其余因素如溶酶体组织蛋白酶的释放、僵直前肌肉中Ca2+释放引起的糖酵解加速及肌肉的物理性破坏(但需要巨大的能量)也可能对肉品嫩度的提高有一定的贡献。嫩度很大程度上取决于肌肉细胞的完整性，不同于电刺激及拉伸技术，在一定的条件下，不需要明显的温升，便可实现细胞膜的不可逆通透，PEF可作用于僵直前/后肌肉，但其研究结果却相当有趣。

　　如图7（略）所示，就僵直后肌肉应用而言，PEF处理后对嫩化进程有影响，过往研究对于“PEF 是否可以改善嫩度”结果不一致。主要矛盾点在于：(1)高强度PEF处理后，是否给予合适的成熟时间(肉品的嫩化是一个生化过程)；(2)低强度PEF是否诱导纤维物理破坏，即低强度PEF可能不足以诱导细胞膜的不可逆通透，细胞器释放 Ca2+和酶能力受限；(3)肌肉的解剖学及生理学差异(会影响生热、电导率、纤维类型组成及细胞膜特性)是否引起不同肌肉表现为频率依赖性或重复依赖性。值得注意的是，高强度PEF作用可能会因为欧姆热引起温升，造成参与嫩化进程中蛋白与酶的变性、肉块温度的提高，从而致韧。就僵直前肌肉而言，研究表明不同部位肌肉可能会表现出截然相反的结果(不论单次应用还是重复应用)，这可能归因于PEF对这些肌肉保水性的不同影响。

　　虽然当前PEF应用肉品嫩化研究有限，但其在嫩化进程中表现出潜在作用，不同肌肉类型需要不同的最佳参数，需要更多的研究以评估 PEF在商用型肉品中的肉而不是已经研究过的肉(多研究牛肉)，不同肌肉引起的嫩度差异需作进一步的研究，从而更好地理解PEF影响肌肉结构及嫩度的机理。此外，需探究不同强度PEF及重复次数的交互设计以获得更理想的感官属性。

　　3  讨论

　　以上所述新兴物理技术，就技术而言，主要是通过对肌肉结构的物理破坏、增强蛋白水解与加快成熟进程、促进肌肉相关蛋白的变性与溶解，以达到嫩化目的。这些新兴嫩化技术能否获得最佳利用，需针对不同胴体肌肉、不同市场(食品服务行业、鲜品、出口品)、不同消费群体喜好进行不断地调整。过往研究表明，消费者愿意为有保证的嫩化肉多付费，因而这些新兴技术会引起人们的兴趣，这些技术在工业上的实施将取决于经营者的创新意愿、技术资本、运营成本与投资-效益价值。了解每种技术如何诱导嫩化的机制将有助于确定某一特定分割肉或特定市场所需的理想组合技术。即使当前多采用传统与新兴方法联合处理，以取长补短，获得“1+1＞2”的嫩化效果，但不可否认的是，这些新技术在商用中还不能大面积投入，成本因素之外，研究的重现性低，需进一步深化基础研究。此外，加工方式如低温长时蒸煮等也可嫩化肉品，亦可开发新型加工方式及工艺。最后，还需针对肉品嫩度无损检测方法(如高光谱成像)及嫩度生物标记物(如热休克蛋白)等作进一步地探索。