槲皮素抑制冷藏猪肉糜氧化及改善其品质特性

　　摘要：为探究槲皮素对冷藏猪肉糜氧化及品质特性的影响，将不同添加量（0、0.05、0.10g/kg和0.20g/kg）的槲皮素添加到肉糜中，对硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acids reactive substances，TBARS）值、蛋白总巯基含量、蛋白羰基含量、表面疏水性以及肉糜的色泽、蒸煮损失和质构特性进行测定。结果表明：各个添加量的槲皮素均能显著降低肉糜的TBARS值（P＜0.05）；在贮藏第9天，槲皮素添加量为0.10g/kg和0.20g/kg时，蛋白质巯基损失和表面疏水性增加均受到了明显抑制；在贮藏第1～6天，槲皮素添加量为0.20g/kg时，显著抑制了羰基化合物的生成（P＜0.05）；槲皮素添加量为0.10g/kg时，能有效提高肉糜的红度；在贮藏第6天和第9天，槲皮素添加量为0.05g/kg和0.10g/kg时，蒸煮损失率显著降低（P＜0.05）；槲皮素能显著提高肉糜在贮藏过程中的弹性、硬度和咀嚼度（P＜0.05）。因此，以槲皮素为抗氧化剂抑制肉及肉制品氧化时，应考虑添加量对肉品品质的影响。

　　关键词：槲皮素；冷藏猪肉糜；脂肪氧化；蛋白质氧化；品质特性

　　脂肪氧化和蛋白质氧化是除微生物污染外对肉及肉制品品质影响最大的两个因素，二者都是由复杂的自由基链式反应引发的。通常，脂肪氧化多发生于不饱和脂肪酸，环境中存在的自由基和氧化物与不饱和脂肪酸反应生成过氧化物，过氧化物再最终裂解成醛、酮、酸等小分子物质；而蛋白质氧化主要是由自由基和氧化物直接作用于蛋白质的氨基酸侧链造成的，最终导致多肽链断裂、侧链氨基酸氧化修饰以及蛋白质交联。因此，脂肪氧化和蛋白质氧化会引起脂类和蛋白质降解，二者同时发生并相互影响，对肉及肉制品的营养价值、功能特性和感官品质产生不良影响。因此，为了防止肉制品变质以及变质所带来的危害，抑制肌肉中脂肪氧化和蛋白氧化是非常重要的。通常在肉制品加工和流通环节中采用真空包装等物理措施，此外，添加适量安全、高效的抗氧化剂也是一种有效的方法。目前国内外广泛使用的抗氧化剂多为化学合成物质，但已有研究显示，化学合成抗氧化剂存在一定的安全风险，部分合成抗氧化剂对人体有一定的负面影响；因此，寻找更加有效、安全的天然抗氧化剂一直是肉制品领域的研究主题。

　　槲皮素化学名为3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮，属于黄酮醇类化合物，广泛存在于蔬菜、水果、中草药等植物中。槲皮素由黄酮类化合物2-苯基色原酮衍生而来，酚苯环结构中有5个酚羟基基团，其中C环上的3-羟基-4-酮、5-羟基-4-酮和B环上的3’,4’-二羟基结构使槲皮素分子有超高离域共轭体系、超强配位能力氧原子和独特空间构型，极易与Mg2+、Fe2+、Cu2+金属离子发生螯合作用，形成复杂的螯合物。其结构特性赋予槲皮素抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤、抗细胞凋亡等多种生物活性。已有研究表明，槲皮素能抑制肌原纤维蛋白乳化体系中脂肪的氧化，并能减少蛋白质羰基氧化产物的形成，如α-氨基己二酸半醛、α-氨基己二酸、γ-谷氨酸半醛。但是总体来看，槲皮素作为抗氧化剂在肉品中的应用还缺乏相关的基础研究。此外，在研究槲皮素抑制肉品氧化作用的同时，还有必要考虑其对肉品品质的影响，因为已有研究证实，多酚类物质在高浓度下能够降低肌原纤维蛋白的功能特性。因此，本实验以槲皮素为抗氧化剂，探究其对冷藏猪肉糜脂肪和蛋白氧化的抑制效果，同时研究其对肉糜色泽、蒸煮损失和质构特性的影响，为槲皮素在肉品中的应用提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　猪背最长肌、肥膘，购于当地超市。

　　丁基羟基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）；槲皮素。氯化镁、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠、氯仿、甲醇、氯化钠等试剂均为国产分析纯。

　　1.2  仪器与设备

　　Allegra 64R冷冻离心机；FE20pH计、PL203型电子分析天平；T25数显型均质机；UV2550紫外-可见光分光光度计；TA-XT2i质构仪；CR-400色差仪。

　　1.3  方法

　　1.3.1  肉糜制作和蛋白质提取方法

　　1.3.1.1  肉糜制作

　　肉糜的制备在4℃冷库中进行。配方为：70%（质量分数，下同）猪背最长肌、10%肥膘、18%水和2%氯化钠。将猪肉用绞肉机绞碎后，分为5个处理组：第1组为空白组（即不添加任何抗氧化剂）；第2～4组分别添加0.05、0.10、0.20g/kg槲皮素，第5组添加0.2g/kgBHA。将0.025、0.050、0.100g槲皮素和0.10gBHA分别用2mL体积分数95%的乙醇溶液溶解后，再加到肉糜中，肉糜总质量为500g。充分混合均匀后，将肉糜制成50g的肉饼，直径约7cm，厚度约1cm，每3个肉饼放入一个聚丙烯包装盒中，用保鲜膜封好，置于4℃冰箱冷藏，分别在第1、3、6、9天测定各项指标。

　　1.3.1.2  蛋白质的提取与浓度的测定

　　肌原纤维蛋白提取按照Park等的方法进行。称取适量肉糜加入4倍体积的4℃提取液（10mmol/L磷酸缓冲溶液，含100mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl2和1mmol/L二胺四乙酸，pH7.0），匀浆60s，离心15min（3500 r/min、4℃）。取沉淀，重复提取两次。去上清液，用4倍体积4℃100mmol/L NaCl溶液重复清洗3次。最终用4层纱布过滤，用0.1mol/L HCl溶液调节pH值至6.0，然后再冷冻离心15min（3500r/min、4℃），去上清液。称质量后4℃条件下冷藏。蛋白质浓度用双缩脲法测定，牛血清白蛋白作为标准蛋白。

　　1.3.2  硫代巴比妥酸反应产物值的测定

　　硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acids reactive substances，TBARS）值的测定参照Jongberg等的方法，并做适当修改。准确称取绞碎的猪肉糜5g，加入15mL75g/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-1g/L焦性没食子酸-1g/L乙二胺四乙酸混合溶液，然后11000r/min均质60s，4℃冷冻离心5min（3500r/min），过滤后取滤液，加2.5mL0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液于装有2.5mL滤液的试管中，然后沸水浴反应50min显色，冷却后在532nm波长处测定吸光度（A）。TBARS值以每千克肉样品中所含的丙二醛质量表示，计算如式（1）所示。

　　（1）

　　式中：V 表示样品体积/mL；M表示丙二醛的摩尔质量（72.063g/mo l）；ε表示摩尔吸光系数（156000L/（mol·cm））；I表示光程（1cm）；m表示肉样质量/kg。

　　1.3.3  总巯基含量的测定

　　总巯基含量的测定按照Yang Hua等的方法并加以修改。将蛋白溶液稀释成5mg/mL，取1mL加入8mL Tris-甘氨酸溶液，均质后，冷冻离心15min（10 000 r/min、4℃），除去不溶性蛋白。取4.5mL上清液，加入0.5mL Ellman试剂，混匀，在室温下避光放置30min后，在412nm波长处测定吸光度。使用摩尔吸光系数13600L/（mol·cm）计算蛋白中总巯基的含量。

　　1.3.4  羰基含量的测定

　　参考Ortu?o等的方法测定羰基含量，并略加修改。将蛋白质溶液稀释成5mg/mL，向3mL蛋白溶液中加入1mL10mmol/L二硝基苯肼溶液，在室温下静置1h（每15min振荡一次），然后添加1mL20%TCA溶液，冷冻离心5min（10000r/min，4℃），取沉淀，用乙酸乙酯-乙醇（体积比1∶1）洗涤沉淀3次以除去未反应的试剂，加入3mL6mol/L盐酸胍溶液在37℃下溶解蛋白沉淀，然后冷冻离心5min（10000r/min，4℃）去除不溶物，所得的溶液在370nm波长处测定吸光度。空白组则是加入1mL 2mol/L HCl溶液。使用摩尔吸光系数22000L/（mol·cm）计算蛋白中羰基含量。

　　1.3.5  表面疏水性的测定

　　参照Chelh等的方法，取1mL 5mg/mL的蛋白溶液，加入200μL的1mg/mL溴酚蓝，混匀，室温下振荡10min，然后离心15min（4℃、6000r/min），取上清液稀释10倍，在595nm波长处测定吸光度，对照组为磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）替代蛋白溶液。表面疏水性可用溴酚蓝结合量表征，具体计算见公式（2）。

　　（2）

　　1.3.6  肉糜颜色的测定

　　使用手持色差仪测定肉糜颜色，先将色差仪进行校正，将肉样放置于自然光充足的平面上，垂直将色差仪置于肉糜上方，镜面紧扣肉面（不漏光），随机在每个样品3个不同的位置测定数据，分别得到L*、a*和b*值，将3次测量值的平均数作为色差读数，重复3次。

　　1.3.7  肉糜蒸煮损失率的测定

　　准确称取质量为m1（30～35g）的均匀肉糜，填装到50mL塑料离心管中，然后低速离心（1500r/min、4℃、5min）除气泡，然后将肉样置于85℃水浴锅中，没过肉样蒸煮30min，蒸煮后冷却至室温，用滤纸吸干水分，然后称肉糜质量，记为m2/g。称完后，放在4℃环境中保存。蒸煮损失率计算按公式（3）进行。

　　（3）

　　1.3.8  熟肉糜的质构分析

　　将煮熟的肉糜切成直径2cm、高度1cm的柱状样品。质构仪参数设定为：P50铝合金探头、测前速率2mm/s、测中速率1mm/s、测后速率1mm/s、间隔时间5s、触发力5.0kg。每组6个平行，重复3次。

　　每个实验重复3次，结果表示为平均值±标准差。数据统计分析采用SPSS 19.0软件中的Linear Models程序进行处理，差异显著性分析采用LSD程序，P＜0.05表示差异显著。作图使用SigmaPlot12.5软件。

　　同一添加组、不同贮藏时间小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；

　　同一贮藏时间、不同添加组大写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

　　硫代巴比妥酸实验是目前应用于监测含油脂食品氧化酸败最广泛的方法之一。如图1所示，各组肉糜的TBARS值在冷藏过程中整体呈上升趋势，尤其是空白组，脂肪氧化程度大幅度增加，在第6天和9天时急剧升高，这可能是氧化后期初级氧化产物氢过氧化物大量裂解为醛、醇、酮等小分子氧化产物所致。添加槲皮素后，各组的TBARS值均显著低于空白组（P＜0.05），这可能是因为槲皮素结构中B环上的3’,4’-OH基团具有较强的清除自由基的能力，能够清除不饱和脂肪酸的游离基，从而阻止其生成过氧化物，有效避免了脂肪氧化。通过对比同一冷藏时间、不同槲皮素添加量之间的TBARS值，发现除冷藏第1天时，0.05g/kg槲皮素组的TBARS值显著高于其他处理组（P＜0.05）之外，其他同一冷藏时间、不同添加量之间均无显著差异（P＞0.05），且此时槲皮素组的TBARS值与BHA组之间差异也不显著（P＞0.05）。以上结果说明，槲皮素能有效降低肉糜在冷藏过程中的氧化程度，但添加量对抑制氧化效果的影响不大，且其作用效果与BHA相当。

　　在肌原纤维蛋白中，巯基含量较高且敏感性强，易被氧化成二硫键，导致蛋白质发生聚合和交联，故巯基含量可作为判定蛋白氧化程度的指标之一。如图2所示，各组巯基含量在冷藏过程中均逐渐降低，且冷藏第1～6天时，添加槲皮素和BHA均不能降低巯基损失的程度，说明此时二者不能有效抑制蛋白质氧化的发生。冷藏第9天时，0.05g/kg槲皮素组的巯基含量略高于空白组，但差异不显著（P＞0.05），0.10g/kg和0.20g/kg槲皮素组以及BHA组的巯基含量均显著高于空白组（P＜0.05），说明随着贮藏时间的延长，较高添加量的槲皮素对蛋白质氧化有相对较好的抑制作用。肌原纤维蛋白中巯基含量降低是由于自由基攻击蛋白分子导致其空间结构发生变化，促使内部包埋的巯基暴露，被氧化成二硫键。而槲皮素作为一种多酚物质，其分子结构中的3-OH基团与类黄酮结构中苯氧自由基通过电子共轭和错位形成稳定的平面立体结构，可以抑制自由基的产生，减少巯基的损失。Procházková等证实槲皮素的高抗氧化活性取决于其2,3-双键和4-羰基结合Fe2+的螯合作用，该作用可阻碍槲皮素对蛋白质结构的攻击。

　　2.3  槲皮素对肉糜蛋白质羰基含量的影响

　　蛋白质羰基含量可作为蛋白质氧化的一个重要指标，羰基的形成是一个复杂的过程，主要是由活性氧导致肽链的断裂及活性氧攻击氨基酸分子的氨基或亚氨基产生，经反应最终生成NH3和相应的羰基衍生物。羰基含量越高，蛋白质氧化损伤的程度越高。由图3可知，随贮藏时间的延长，羰基含量不断增加，贮藏第1～9天，空白组羰基含量由3.56nmol/mg上升到4.34 nmol/mg（P＜0.05），说明氧化促使蛋白侧链羰基化进程不断加深。在贮藏1～6d时，除0.20g/kg槲皮素组的羰基含量显著低于空白组外（P＜0.05），其他槲皮素组均与空白组差异不显著（P＞0.05），说明槲皮素在较高添加量时能够有效抑制蛋白质氧化，其抑制效果归因于B环上3’,4’-OH基团对自由基的清除作用，含量越高则清除作用越强，这与Utrera等的研究结果一致。此外，槲皮素结构中的5个酚羟基基团和4-羰基结构，能够有效清除自由基，与金属离子螯合也可以阻止蛋白羰基化过程，减少羰基化合物的生成，抑制蛋白质氧化。

　　2.4  槲皮素对肉糜蛋白质表面疏水性的影响

　　疏水相互作用对蛋白质的结构和功能特性具有重大意义。疏水相互作用是一种非共价键相互作用，表面疏水性影响大分子间的相互作用，所以常用表面疏水性反映蛋白质构象的变化。一般用溴酚蓝的结合量来表示表面疏水性的大小，蛋白质疏水性氨基酸残基结合的溴酚蓝的量越大，表面疏水性就越高，则可说明内部疏水基团暴露的就越多，蛋白质构象发生的变化就越大。由图4可知，随贮藏时间延长，肌原纤维蛋白的表面疏水性呈上升状态，这是由于蛋白质被氧化导致构象发生变化，促使内部疏水性基团暴露，表面疏水性不断升高。贮藏第1天时，除0.20g/kg槲皮素组外，其他组的表面疏水性均显著高于空白组（P＜0.05），这可能是由于少量槲皮素与蛋白相互作用，打开部分蛋白构象，促进了疏水性基团的暴露，从而导致了表面疏水性增加。而在贮藏第3～9天时，除第6天添加量为0.05g/kg时的表面疏水性略高于空白组，其他各槲皮素组的表面疏水性均低于空白组，尤其是在第9天时，0.10、0.20g/kg槲皮素组的表面疏水性显著低于空白组（P＜0.05），这是由于槲皮素可与蛋白质疏水区域发生非共价结合，降低了溴酚蓝与疏水基团结合的几率，表面疏水性降低；槲皮素还可通过与蛋白质发生共价交联，形成巯基-醌或氨基-醌加成物，导致蛋白质形成相互缠结的大分子聚集体，将疏水基团掩蔽于其中；此外，蛋白质分子之间也可能发生疏水相互作用形成聚集物，掩盖原本的疏水位点，使表面疏水性降低。

　　注：同一指标同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；同行肩标大写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表2同。

　　肉及肉制品的颜色是消费者对肉品质量评估的主要依据，其颜色主要取决于肌肉中色素物质肌红蛋白和血红蛋白的含量和变化状态。由表1可知，贮藏第1天时，0.10、0.20g/kg槲皮素和BHA组的猪肉糜亮度（L*值）显著高于空白组（P＜0.05），说明较高添加量的槲皮素对猪肉糜的亮度有提高作用。贮藏时间延长至第9天时，空白组的L*值高于槲皮素和BHA组，其可能的原因是槲皮素和BHA的添加有利于肉糜内部水分的保持，从而降低水分表面渗出率，减弱光的反射程度，使L*值下降。

　　贮藏过程中，空白组肉糜的红度（a*值）显著下降（P＜0.05），这是由于猪肉糜中的肌红蛋白和血红蛋白氧化程度不断加重，逐渐变为红褐色，促使肉糜颜色变暗。贮藏过程中，槲皮素和BHA组肉糜的a*值均高于空白组，其中效果最显著的是0.10g/kg槲皮素组，这可能是由于槲皮素特有的酚羟基结构与肌红蛋白竞争脂质过氧化基团，抑制肌红蛋白氧化，从而稳定猪肉糜的颜色。而槲皮素添加量为0.2g/kg时a*值降低，这主要是槲皮素本身颜色的影响所致。

　　2.6  槲皮素对肉糜蒸煮损失率的影响

　　蒸煮损失率能够表征肌肉的保水性，主要反映生肉到熟肉的加热过程中肉样水分的流失情况，蒸煮损失率越大，则说明肉样的保水性越差。由图5可知，随贮藏时间的延长，各组肉糜的蒸煮损失率也不断升高，其中空白组蒸煮损失由25.02%显著上升至贮藏末期的34.35%（P＜0.05）。这与余小领等的研究结果一致，可能的原因是随贮藏时间的延长，肉中蛋白质不断溶出，分子不断变小，使蛋白系水能力下降，从而导致蒸煮损失增加；此外，蛋白质氧化破坏蛋白质结构中C＝O和N—H基团与水分子之间的结合能力，氧化后凝胶网络孔隙增多，使蛋白质的水合作用有所降低，也会导致蒸煮损失增加。在贮藏1、3d时，所有处理组肉糜的蒸煮损失与空白组相比差异均不显著（P＞0.05），说明贮藏初期，槲皮素与肉糜中蛋白质的相互作用对其保水性的影响不明显；贮藏第6、9天时，0.05g/kg和0.10g/kg槲皮素组肉糜的蒸煮损失率显著低于空白组（P＜0.05），这可能是由于槲皮素与蛋白质发生共价交联，起到“桥接”连接蛋白质的作用，利于蛋白质凝胶网络结构的形成，从而增加了肉糜的系水能力；此外，适量槲皮素的加入能够促进蛋白质功能基团的充分暴露，有利于热凝胶形成过程中蛋白质分子之间的相互作用，也会提高肉糜的保水性。在整个贮藏过程中，0.20g/kg槲皮素组肉糜的蒸煮损失率略低于空白组，但差异一直不显著（P＞0.05），说明槲皮素添加量过高反而不利于肉糜凝胶保水性的提高，这可能是由于过量的酚类物质覆盖在蛋白质表面或与蛋白质分子的过度结合，从而削弱了蛋白质分子之间的相互作用，不利于凝胶网络结构的形成。

　　2.7  槲皮素对肉糜质构特性的影响

　　食品的质构特性是影响消费者接受某种食品的重要因素之一。如表2所示，肉糜的质构特性分别由硬度、弹性、咀嚼度和回复性等指标反映。在贮藏过程中，空白组的硬度显著下降（P＜0.05），这可能是因为氧化改变了蛋白结构，使其形成凝胶能力变差，从而使肉糜的硬度下降。而槲皮素和BHA组的硬度、弹性、咀嚼度和回复性随贮藏时间的延长，整体呈显著上升趋势（P＜0.05），说明槲皮素与BHA能通过抑制蛋白的氧化来阻止蛋白变性，从而有利于蛋白网络结构的形成，改善肉糜的质构特性。贮藏第1天时，槲皮素组的硬度和咀嚼度均低于空白组；随着贮藏时间的延长，槲皮素组的硬度、弹性和咀嚼度逐渐高于空白组，说明槲皮素与蛋白的充分结合增强了蛋白凝胶结构的强度，且槲皮素的多酚结构能够淬灭自由基，防止蛋白氧化产生的变性和裂解，使肉糜结构更稳定。

　　随冷藏时间的延长，空白组肉糜的脂肪和蛋白质氧化程度不断加深，TBARS值不断增加，总巯基损失量、羰基含量和表面疏水性不断增大，致使肉糜颜色变暗，蒸煮损失增大，肉糜硬度和弹性下降；而添加槲皮素后，能显著减少TBARS的生成，降低脂肪氧化程度；高添加量的槲皮素对降低巯基损失、增加表面疏水性以及减少羰基化合物生成的效果较好；低添加量的槲皮素能有效保持肉糜色泽，降低肉糜的蒸煮损失；槲皮素能增加肉糜硬度和弹性等。因此，以槲皮素作为抗氧化剂时，应选择合适的添加量，使其不仅可起到抑制肉品氧化的作用，还可以改善肉品品质特性。